جداسازی ژن‌های بتا1 و3- گلوکاناز از یونجه یکساله، بیان آنها در باکتری BL21 E.coli و بررسی خاصیت ضد قارچی پروتئین های بیان شده

نوع مقاله: علمی پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد بیوتکنولوژی کشاورزی

2 کارشناس ارشد زراعت و اصلاح نباتات

3 دانشجوی دکتری اصلاح نباتات واحد علوم و تحقیقات تهران

چکیده

پروتئین های مرتبط با بیماریزایی (Pathogenesis-related protein) آن دسته از ترکیبات پروتئینی هستند که توسط گیاه میزبان در پاسخ به حمله عوامل بیماری‌زا یا تنش‌های محیطی تولید می شوند. تاکنون بتا1 و3-گلوکانازهای زیادی در گیاهان مختلف شناسایی شده است که خاصیت ضد قارچ آنها در شرایط آزمایشگاه بررسی شده است. هدف این تحقیق جداسازی ژن های بتا1و3- گلوکاناز یونجه یکساله، کلون ژن‌ها، بیان  فراوانی و بررسی  فعالیت های فیزیولوژیک و خاصیت ضد قارچ پروتئین های به دست آمده در شرایط آزمایشگاه می باشد. در این تحقیق با همردیف سازی ژن های بتا1 و3-گلوکاناز یونجه چند ساله و نخود روی ژنوم یونجه یکساله سه چارچوب خواندن با شباهت بالای 50% و دارا بودن رمز شروع و پایان، شناسایی و جداسازی شده و قطعات به ناقل PET21c منتقل و در باکتری BL21 E.coli بیان شد. با تکنیک SDS-PAGE  مشخص شد که این پروتئین ها به صورت اجسام نا محلول تولید شده اند. خاصیت ضد قارچی این پروتئین ها پس از تا شدن و به دست آوردن ساختار فضایی صحیح روی قارچ های  Alternaria alternata و Fusarium graminearum آزمایش شد. نتایج آزمون بررسی خاصیت ضد قارچ پروتئین ها پس از تجزیه و تحلیل آماری با نرم افزار SAS در سطح 5% معنی دار بود.

کلیدواژه‌ها


1-  Adams, D. J. 2004.  Fungal cell wall chitinases and glucanases. Microbiol. 150 : 2029-2035.

2- Akiyama, T. and  Pillai, M. A. 2001. Molecular cloning, characterization and in vitro expression of a novel endo-1,3-β-glucanase up-regulated by ABA and drought stress in rice (Oryza sativa L.). Plant Sci. 161: 1089–1098.

3- Choi, H. K., Kim, D., Uhm, T., Limpens, E., Lim, H., Mun, J. H., Kalo, P., Penmetsa, R. V., Seres, A., Kulikova, O., Roe, B. A., Bisseling, T., Kiss, G. B. and Cook, D. R. 2004. A sequence-based genetic map of Medicago truncatula and comparison of marker colinearity with M.sativa. Genetics. 166: 1463-1502.

4 - Datta, S. k.  and  Muthukrishnan, S. 1999. Pathogenesis-related protein in plant,led.,CRC Press.

5- Ding, C. K., Wang, C., Gross, K. C. and Smith, D. 2002. Jasmonate and salicylate induce the expression  of pathogenesis-related-protein genes and increase resistance to chilling injury in tomato fruit. Planta. 214: 895–901.

6-Funnell, D., Lawrence, C., Pedersen, J. and Schardl, C. 2005. Expression of the tobacco b-1,3-glucanase gene, PR-2d, following induction of SAR with Peronospora tabacina. pysiol Mol Plant Pathol.65 (6) 285-296.

7- Hell, M. and Bostock, R. M. 2002. Induced systemic resistance (ISR) against pathogens in the context of induced plant defence. Annals of Botany. 89: 503-512.      

8- Huecas, S., Villalba, M. and Rodríguez, R. 2001. Ole e 9, a major olive pollen allergen is a 1,3-β-glucanase. Isolation, characterization, amino acid sequence and tissue specificity.  Biol chem. 276(30): 27959-27966.

9-Huguet, T. and Prospéri,  J. M. 1998. Medicago truncatula : A legume  model  plant. Plant physiol.110: 1167-1169.

10-Ji, C. and  Kuc, J. 1995. purification and characterization of an acidic beta-1,3-glucanase from cucumber and its relation ship to systemic disease resistance induced by colletotrichum lagenarium and tobacco necrosis virus. Plant Microbe. 8(6): 899-905.

11-Kleber-Janke, T. and  Becker, W. M. 2000. Use of modified BL21(DE3) Escherichia coli cells for high-level expression of recombinant peanut allergens affected by poor codon usage. Protein express and purification.  19 (3): 419-424.

12 Knoche, K. and  Kephart, D. 1999. Cloning blunt-end pfu DNA polymerase generated PCR fragments into PGEM – T vector systems.  Promega notes.  No.71, p.10.

13-Koffmann-Sommergruber, K. 2001. Pathogenesis-related (PR) proteins identified as allergens. Biochem.Soc.Trans. 30: 930-935.

14- Krishnaveni, S., Muthukrishnan, S., Liang, G. H., Wilde, G.  and    Manickan, A. 1999. Induction of chitinases and b-l,3-glucanases in resistant and susceptible cultivars of sorghum in response to insect attack, fungal infection and wounding. Plant Sci. 144:  9-16.

15- Leubner-Metzger, G. 2005. β-1,3-Glucanase gene expression in low-hydrated seeds as a mechanism for dormancy release during tobacco after-ripening. the plant journal.  41:(1) 133-134

16-Leubner- Metzger, G. 2003. Functions and regulation of of -1,3-glucanases during seed germination, dormancy release and after-ripening. Seed Science Research.13(1): 17-34.

17- Marchuk, D., Drumm, M., Saulino, A. and  Collins, F. 1990. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Research. 19(5): 1.

18- Muthukrishnan, S., Liang, G. H.,  Trick, H. N. and Gill, B. S. 2001. Pathogenesis-related proteins and their genes in cereals. Plant cell. 64(2):93-114.

19- Ng, T. B. 2004. Antifungal proteins and peptides of leguminous and non-leguminous origins. Peptides. 25: 1215–1222.

20- Odjakova, M. and  Hadjiivanova, C. 2001.  The complexity of pathogen defense in plants. Plant Physiol. 27:101-109.

21- Pan, Sh. and  Malcolm, Ba. 2000. Reduced background expression and improved plasmid stability with pET vectors in BL21(DE3). Biotech. 29(6): 1234-1238.

22- Peumans. W. J., Barre, A., Derycke, V., Rouge, P., Zhang, W., May, G., Delcour, J.   A., Leuven, F. and Van Damme, E. J. M. 2000. Purification , characterization and structural analysis of an abundant B-1,3-glucanase from banana fruit .Biochem .  267: 1188- 1195.

23- punja, z. k. 2001. genetic engineering of plants to enhance resistance to fungal pathogens- a review of progress and future prospects. plant pathol. 23: 216-235.

24- Receveur-Bre´chot, V., Czjzek, M., Barre, A., Rousse, A., Peumans, W. J., Van Damme, E. J .M. and Rouge, P. 2006. Crystal structure at 1.45-Å resolution of the major allergen endo-β-1,3-glucanase of  banana as a molecular basis for the latex-fruit syndrome. Proteins.  63:235–242 .

25- Sambrook, J. and Russell, D. W. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Third Edition. CSHL press.

26- Sticher, L., Mauch-Mani, B. and  Metraux, J. P. 1997. Systemic acquired resistance. Annu. Rev. Phytopathol. 35:235-270.

27- Stintzi, A., Heitz, T., Prasad, V., Wiedemann-Merdinoglu, S., Kauffmann, S., Geoffroy, P., Legrand, M. and Fritig, B. 1993. Plant pathogenesis-related proteins and their role in defense against pathogens. Biochim. 75(8 ):  687-706.

28- Sun . B., Dc.Li, Xy.Ci, Rf. Guo and Wang, Y. 2004.  Induction ,purification and antifungal activity of beta-1,3-glucanase from wheat leaves. Plant Pathol. 30(4): 399-404.

29- Thatcher, L. F., Anderson, J. P. and Singh, K. 2005. Plant defence responses: what have we learnt from Arabidopsis. Plant Biol. 32: 1-19.

30- Van Loon, L. C. 1997. Induced resistance in plants and the role of pathogenesis-related proteins. Plant Pathol. 103: 753-765.

31- Van loon, L. C. and  Van strien, E. A. 1999. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins.  Physiol and mol  plant pathol. 55: 85-97.

32- Wang, Y., Kausch, A. P., Chandlee, J. M., Luo, H., Ruemmele, B. A., Browning, M., Jackson, N. and Goldsmith, M. R. 2003. Co-transfer and expression of chitinase, glucanase, and bar genes in creeping bentgrass for conferring fungal disease resistance. Plant Sci. 165( 3): 497-506.

33-Watson, B. S., Asirvatham, V. S., Wang, L. and Sumner, L. W. 2003. Mapping the  proteome of barrel medic ( Medicago truncatula). Plant physiol. 131: 1104-1123.

34-Wrobel-Kwiatkowska, M., Lorenc-Kukula, K., Starzycki, M., Oszmianski, J., Kepczynska, E. and      Szopa, J. 2004. Expression of β-1,3-glucanase in flax causes increased resistance to fungi.   Physiol  and Mol Plant Pathol. 65(5 ):245-256.

 35- Yoshikawa, M., Tsuda, M. and Takeuchi, Y. 1993. Resistance to fungal diseases in transgenic tobacco plants expressing the phytoalexin elicitor-releasing factor ,β-1,3-endo glucanase, from soybean. Naturwiss.  80: 417-428.